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通道載玻片--IL-33免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)

更新時(shí)間:2016-06-20   更新時(shí)間:2016-06-20   點(diǎn)擊次數(shù):3823次

細(xì)胞的免疫熒光實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基礎(chǔ)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn),傳統(tǒng)的方法是在培養(yǎng)板中放入預(yù)先處理好的蓋玻片,待細(xì)胞貼壁后,使用鑷子將蓋玻片拿出再開始進(jìn)行固定,染色等系列工作。為了簡(jiǎn)化這一工作,一系列底部適合直接成像的細(xì)胞耗材應(yīng)運(yùn)而生,如圖:

日本的科研人員在研究細(xì)胞因子IL-33在Ca9-22細(xì)胞中免疫熒光染色試驗(yàn)時(shí)使用了一種通道載玻片。IL-33是一種在內(nèi)皮細(xì)胞中常規(guī)表達(dá)的細(xì)胞因子,其參與調(diào)節(jié)了先天免疫細(xì)胞的Th2 細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。研究人員想研究增強(qiáng)IL-33表達(dá)的牙周內(nèi)皮細(xì)胞中牙周菌Porphyromonas gingivalis所發(fā)揮的作用。研究人員使用牙周菌P.gingivalis刺激Ca9-22細(xì)胞,再測(cè)試其中IL-33的表達(dá)。

 

Porphyromonas gingivalis Gingipain-Dependently Enhances IL-33 Production in Human Gingival Epithelial Cells

H. Tada, T. Matsuyama, T. Nishioka, M. Hagiwara, Y. Kiyoura, H. Shimauchi and K. Matsushita

PloS one, 2016, 10.1371/journal.pone.0152794

 

一)實(shí)驗(yàn)材料:

1)Ca9-22細(xì)胞

2)牙周菌P.gingivalis      50 μg/ml

3)多聚甲醛溶液            4%

4)BSA                    1%PBST溶液

5)藻紅蛋白偶聯(lián)的大鼠抗人IL-33抗體  (clone, 390412; R&D Systems)

6)DAPI

8)六通道載玻片          ibiTreat,德國(guó)ibidi公司,80606

圖一:通道載玻片示意圖。細(xì)胞的免疫熒光實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)化,并且節(jié)約試劑(單通道30μl),細(xì)胞分布及其均勻,成效效果好。

 

二)實(shí)驗(yàn)步驟

1)單通道鋪入3×105 Ca9-22細(xì)胞,37℃,5%CO2環(huán)境中孵育過(guò)第二天待細(xì)胞貼壁。

2)使用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基,輕輕沖洗通道,移除未貼壁細(xì)胞(圖二)。

 

圖二:沖洗換液方法,藍(lán)色代表新的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基

3)用50 μg/ml牙周菌P.gingivalis,(MOI為0.13)加入通道中,刺激Ca9-22細(xì)胞4天

4)用4%的多聚甲醛固定15分鐘

5)用1%BSA的PBST溶液封閉30分鐘

6)使用0.5μg/ml的藻紅蛋白偶聯(lián)的大鼠抗人IL-33抗體4℃孵育1小時(shí)

7)DAPI孵育1分鐘

8)用熒光顯微鏡觀測(cè)數(shù)據(jù)。

 

  • 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 

 

圖三:牙周菌P.gingivalis增強(qiáng)牙周內(nèi)皮細(xì)胞中IL-33的表達(dá)。用50 μg/ml牙周菌P.gingivalis,刺激Ca9-22細(xì)胞后使IL-33(紅色)表達(dá)有顯著的提高。細(xì)胞核(藍(lán)色)

聯(lián)


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